Questo luogo fu originariamente refettorio dell'abbazia vallombrosana di San Salvi e risale agli inizi del XVI secolo. Affrescato da Andrea del Sarto fra il 1511 e il 1527, fino ai primi dell'Ottocento accolse le monache di clausura della Beata Umiltà.
In seguito alle soppressioni religiose del XVIII secolo, divenne di proprietà dello Stato e fu trasformato in deposito.
L'interno ha conservato l'imponente aspetto cinquecentesco degli ambienti originari del convento: la vecchia cucina del refettorio, la "sala del lavabo", con il grande camino del XVI secolo e il lavabo di Benedetto da Rovezzano.
Sempre di Benedetto da Rovezzano sono anche i frammenti in marmo del monumento funebre di San Giovanni Gualberto, fondatore dell'ordine vallombrosano.

Notevolissimo, nella sala del Refettorio, il grande affresco di Andrea del Sarto raffigurante l'Ultima Cena, considerato il capolavoro del pittore, che lo eseguì intorno al 1520.
Il Cenacolo custodisce inoltre una scelta di tavole e di pale d'altare di scuola fiorentina, molte delle quali provenienti da chiese fiorentine e da conventi soppressi.
Di Andrea del Sarto un'Annunciazione, il Cristo in Pietà e il Noli me tangere.
Opere di artisti contemporanei o seguaci di Andrea del Sarto sono la Madonna col Bambino di Giuliano Bugiardini, il San Zanobi che risuscita un fanciullo e la Traslazione del corpo di san Zanobi di Ridolfo del Ghirlandaio, l'Adorazione dei pastori, la Sacra Conversazione e il Noli me tangere del Franciabigio, la Madonna col Bambino e san Giovannino del Pontormo.