Le raccolte degli Uffizi hanno una storia che, lungo l'arco di più di quattro secoli, si interseca con quella della civiltà fiorentina nel suo insieme.
Le prime collezioni medicee costituiscono il nucleo originario della Galleria, ma la vocazione al mecenatismo ha caratterizzato i governanti di Firenze, e i Medici in primo luogo, nel corso dei secoli.

Già nel Trecento si assiste a fenomeni di mecenatismo grazie alla cresciuta importanza delle corporazioni: l'Arte del Cambio commissiona all'Orcagna il Trittico di San Matteo per la sua proprietà di Orsanmichele, l'Arte della Mercanzia fa eseguire a Piero Pollaiolo e successivamente a Botticelli una serie di Virtù per la Sala delle Udienze del proprio palazzo.
Per il primo Quattrocento, si deve al ricchissimo e colto Palla Strozzi l'incarico conferito a Gentile da Fabriano di realizzare l'Adorazione.
Lo stesso Cosimo I si fa protettore di artisti originali come fra Filippo Lippi e commissiona opere di notevole significato morale e politico come la Battaglia di San Romano di Paolo Uccello.
Nel secolo successivo il mercante Angelo Doni commissiona a Michelangelo il suo famoso capolavoro pittorico, la Sacra Famiglia con san Giovannino (o Tondo Doni), mentre Raffaello dipinge per un altro mercante, Lorenzo Nasi, la Madonna del Cardellino.

Le collezioni si arricchiscono di nuovi elementi grazie anche a doni matrimoniali o eredità ricevuti dai granduchi.
Così Ferdinando I riceve in dono la Medusa del Caravaggio dal cardinal Del Monte, Ferdinando II nel Seicento viene in possesso, tramite la moglie Vittoria della Rovere, del dittico di Piero della Francesca e della Venere di Urbino di Tiziano.
Nel Settecento, in particolare durante il granducato di Pietro Leopoldo (1765-1790), vengono acquisiti i dipinti più antichi e si costituisce il nucleo di pittura francese.
Durante tutto l'Ottocento si allestiscono nuove sale e la pinacoteca continua ad arricchirsi di opere importanti, fra le quali la celeberrima Nascita di Venere del Botticelli, agli Uffizi dal 1815, e l'Annunciazione di Leonardo da Vinci, dal 1867.
La definitiva acquisizione della Primavera, la splendida tavola dipinta dal Botticelli intorno al 1482, risale invece al 1919.
Il Novecento ha portato numerosi riordini e restauri, nonché, recentemente, la definitiva sistemazione della Collezione Contini Bonacossi.